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冻干机如何在血液中制备抗菌肽

    如何在血液中制备抗菌肽?抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质,由20~60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。在养殖业里,主要用于替代抗生素作保健;可用于治疗免疫缺陷疾病,主要作用抗菌、免疫调节、修复损伤。

    国内外关于鸡源抗菌肽的研究,主要针对鸡小肠中的抗菌肽,而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在国内外却很少有报道。目前,我国鸡的饲养量很大,屠宰鸡的下脚料鸡血很多,对其进行抗菌肽的提取和研究,是对资源的利用和再开发,是很有必要的。

   鸡血中抗菌肽的提取方法,其特征在于:它包括如下具体步骤:

     一、鸡血采集:从屠宰场采取新鲜鸡血2-3L,使用5%柠檬酸钠抗凝; 

    二、萃取:将新鲜鸡血放置37℃温箱静置l_2h,取上清按照1:4的比例加入0.84%氯化铵溶液,混匀静置3min,常温400r/min离心10min,弃上清按比例加入氯化铵溶液混匀静置3min,再次500r/min离心10min ;弃上清,使沉淀与少量4℃的生理盐水短时间混合,再用200ml的4℃的10%冰醋酸使沉淀悬浮,充分混匀,倒入50ml烧杯,超声波处理50次,然后溶液使用磁力搅拌器混匀搅动于4℃下萃取一夜;次日,将萃取的溶液取出15000r/min离心30min,取上清4℃下保存,沉淀再次混悬于冷的10%醋酸中,充分混匀,混匀搅动于4℃下萃取一夜;第三天将萃取的溶液取出15000r/min离心30min,最后将溶液4℃下保存; 

    三、除酸、浓缩:合并所保存的溶液,将溶液注入透析袋,扎紧袋口,然后将其放入烧杯,再向烧杯中倒入蒸馏水,蒸馏水液面要超过透析袋,4℃下透析除酸,每12h换水一次,直至透析袋外蒸馏水pH大于6,将透析袋放入瓷盘中,撒上聚乙二醇6000,透析浓缩约3-4h后即可将透析袋取出,将浓缩的溶液取出低温冻干,转移至青霉素小瓶中,密封-20℃保存; 

    四、抗菌肽的分离:将冻干样品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25,同时打开柱的下端出口,注意控制流速为lmL/min,5mL/管,用部分收集器收集洗脱液,5mL/管,收集的溶液用紫外分光光度计测其在280nm处的吸收值,将在280nm处有吸收的溶液分装于青霉素瓶中,再在低温中冻干,-80℃保存,取各瓶冻干保存的样品各20mg,分别溶于灭菌双蒸水中,无菌条件下用微孔滤膜过滤样品,将药敏纸片浸泡于过滤后的样品中,浸泡过夜后,用平皿纸片法初筛,收集具有抗菌活性的组分,置于5℃保存; 

   五、抗菌肽的纯化与浓缩:使用超滤装置进行超滤,膜包选用截流分子量为20kD,洗脱液选用0.5%甲醇溶液,滤出液 既 为所要获得的溶液。


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